Μοριακά δίκτυα δυνητικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος

• Κύριος συγγραφέας: Καμπίλαυκος, Παναγιώτης
• Άλλοι συγγραφείς: Σωτηροπούλου-Μπονίκου, Γεωργία
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2015
• Θέματα: Καρκινικά stem κύτταρα; Μελάνωμα δέρματος; Cancer stem cells; Cutaneous malignant melanoma; 616.994 770 7

Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος είναι το αποτέλεσμα της κακοήθους εξαλλαγής των μελανοκυττάρων της επιδερμίδας και χαρακτηρίζεται απο συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η αξιοσημείωτη δε ανθεκτικότητα που επιδεικνύει το προχωρημένο μεταστατικό μελάνωμα στα χημειοθεραπευτικά σχήματα και στην ακτινοθεραπεία κάνει επιτακτική την ανάγκη για νέους, πιο αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αυξανόμενος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη παρουσία και ενεργό συμμετοχή καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells, CSCs) στην ανάπτυξη και μετάσταση του μελανώματος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες EZH2, SOX2 και Oct4 αποτελούν μόρια – κλειδιά στον έλεγχο του ρυθμιστικού δικτύου του stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων (ESCs). Είναι πλέον γνωστό ότι η χρωματίνη στα ESCs περιλαμβάνει περιοχές με «αντιμαχόμενες» τροποποιήσεις ιστονών (bivalent domain), οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε με ενεργή (Η3Κ4me3) ή με ανενεργή κατάσταση της χρωματίνης (H3K27me3), ενώ η απορρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών ελέγχου σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους έχει συσχετισθεί με τη καρκινογένεση στον άνθρωπο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των bivalent domain φαίνεται να έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Polycomb, και ιδιαίτερα ο EZH2 που δρα σαν μεθυλοτρανσφεράση στην επιγενετική τροποποίηση H3K27. Πρόσφατα, μια σειρά από μελέτες έδειξαν ότι CScs στη διηθητική παρυφή του όγκου ενδέχεται να συμμετέχουν ενεργά στη καρκινογένεση. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι η βιολογική διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) οδηγεί υποπληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου να αποκτήσουν ιδιότητες stem κυττάρων, φαίνεται να αποτελεί τον σύνδεσμο μεταξύ μετάστασης και κατάστασης πολυδυναμίας (stemness). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεώρηση αυτή, είναι πιθανό τα CSCs να εντοπίζονται κυρίως στη διηθητική παρυφή ενός όγκου, ενώ επιπλέον οι ιδιότητες stem κυττάρων που έχουν αποκτήσει είναι το αποτέλεσμα κυρίως της ΕΜΤ. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει επομένως εξαιρετικό ενδιαφέρον η προσεκτική και στοχευμένη εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα στην διηθητική παρυφή του μελανώματος, και αυτός ήταν ένας από τους στόχους της παρούσας διαδακτορικής διατριβής. Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, Oct4, SOX2 όπως επίσης και την παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 (bivalent domain) στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανότητα αναγνώρισης και στοχοποίησης καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, με ιδιαίτερη έμφαση στη διηθητική παρυφή του όγκου. Υλικό και μέθοδος. Το ποσοστό κυττάρων με ανοσοθετικότητα για τα αντισώματα έναντι των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, SOX2 και Oct4 όπως επίσης και των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 εκτιμήθηκε σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα 250 του δέρματος, εφαρμόζοντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Από αυτό το σύνολο των 89 δειγμάτων τα 70 αφορούν πρωτοπαθές μελάνωμα δέρματος, ενώ τα υπόλοιπα 19 προέρχονται από υλικό που εξαιρέθηκε κατά τη χειρουργική εκτομή του μεταστατικού μελανώματος. Επιπλέον 14 δείγματα περιείχαν εκτός από καρκινικά κύτταρα μελανώματος και κύτταρα σπίλων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) και H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA). Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI). Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε για τα αντισώματα έναντι των EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ αντίθετα βρέθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση για τους παράγοντες SOX2 και Oct4. Παρατηρήθηκε ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας στα κύτταρα μελανώματος με σημαντικά αυξημένο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με θετική ανοσοχρώση H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή του όγκου. Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο μεταγραφικός παράγοντας EZH2, χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντικά, ενώ παρατηρήθηκε και σε ορισμένες μεμονωμένες περιπτώσεις με τον SOX2. Όσον αφορά τον ΕΖΗ2, βρέθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του παράγοντα στα κύτταρα μελανώματος σε σχεση με τα σπιλοκύτταρα (p=0.02). H πυρηνική έκφραση SOX2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της βασική στιβάδας (p=0.02), όπως επίσης και στα σπιλοκύτταρα συγκριτικά με τα κερατινοκύτταρα της βασικής (p=0.0016) και της υπερβασικής στιβάδας (p=0.027). Η συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης με διάφορες παραμέτρους των ασθενών έδεξε υψηλότερα επίπεδα SOX2 στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045), στα κύτταρα μελανώματος με πάχος όγκου κατά Breslow <1mm (p=0.023), χωρίς εξέλκωση (p=0.009) και με αριθμό μιτώσεων ≤6 μιτ/mm2 (p=0.016). Τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης Oct4 βρέθηκαν υψηλότερα στα σπιλοκύτταρα σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα (p<0.001) αλλά και με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.004). Η μελέτη ωστόσο της κυτταροπλασματικής ανοσοθετικότητας έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων Oct στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της υπερβασικής στιβάδας (p<0.001), όπως επίσης στα μεταστατικά σε σχέση με τα πρωτοπαθή μελανώματα (p=0.025). Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι το προφίλ έκφρασης του Oct4 βρέθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις να αυξάνεται τοπικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός των μελανωμάτων. Τα μελανώματα με υψηλό επίπεδο διήθησης κατά Clark (IV-V) (p=0.038) ή μεγάλο 251 πάχος όγκου κατά Breslow (>1mm) (p<0.001) εμφάνισαν χαμηλότερο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με ανοσοθετικότητα για το αντίσωμα H3K4me2 σε σχέση με τους όγκους με μικρότερο βαθμό διήθησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεταστατικοί όγκοι είχαν χαμηλότερα ποσοστά θετικής ανοσοχρώσης και για τις δύο επιγενετικές τροποποιήσεις, H3K4me2 και H3K27me3, συγκριτικά με τους πρωτοπαθείς όγκους (p=0.0065 και p=0.027 αντίστοιχα). Τέλος, η ανάλυση της παράλληλης ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα μελανώματος έδειξε θετική συσχέτιση των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων (p<0.01), όπως επίσης και μεταξύ του EZH2 και της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 (p=0.03). Ισχυρή συσχέτιση βρέθηκε παρομοίως μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Oct4 και SOX2, τόσο για την πυρηνική όσο και την κυτταροπλασματική εντόπιση (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). Συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργική σημασία των τριών υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων και του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών στην καρκινογένεση, τα ευρήματα μας εισηγούνται ότι οι ΕΖΗ2, SOX2, Oct4 όπως επίσης και οι επιγενετικές τροποποιήσεις Η3Κ4me3 και H3K27me3 αποτελούν εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα, και ιδιαίτερα στη διηθητική παρυφή του όγκου. Η υπόθεση αυτή πρέπει να διεριευνηθεί περαιτέρω, καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει, σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες, ένα μικρό βήμα προς τη κατεύθυνση της στοχευμένης αντικαρκινικής θεραπείας του μελανώματος στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος.