Μελέτη του ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE) στην παθογένεια της οστεοπόρωσης σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών

• Κύριος συγγραφέας: Παπαχρήστου, Νικόλαος
• Άλλοι συγγραφείς: Παπαχρήστου, Διονύσιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2015
• Θέματα: Οστεοπόρωση; Οστική ανακατασκευή; Απολιποπρωτεΐνη Ε; Οστεοβλάστες; Οστεοκλάστες; Osteoporosis; Bone remodeling; Osteoblasts; Runx2; Osx; RANKL; RANK; OPG; Pparγ; 616.716 071

Σκοπός: Πρόσφατα δεδομένα, υποδεικνύουν ότι διαταραχή της ισορροπίας του λιπιδικού μεταβολισμού επηρεάζει τη λειτουργία των κυττάρων του οστού, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τον ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE), βασικού συστατικού του συστήματος μεταβολισμού των χυλομικρών και της VLDL (Very Low-Density Lipoprotein), στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών που έλαβαν δίαιτα πλούσια σε λιπαρά. Υλικά και μέθοδοι: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της apoE (apoE-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου) που τους χορηγήθηκε για 24 εβδομάδες δίαιτα δυτικού τύπου (WTD) πλούσια σε λιπαρά (10 ζώα/ομάδα). Επιλέχθηκε η δίαιτα δυτικού τύπου διότι προσομοιάζει τις διατροφικές συνήθειες του σύγχρονου δυτικού κόσμου. Κάθε 6 εβδομάδες γινόταν μέτρηση σωματικού βάρους. Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Την 24η εβδομάδα τα ζώα θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι και έγιναν ιστολογικές και ιστομορφομετρικές αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner (στατική ιστομορφομετρία) εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού. Με τη χρώση TRAP και την εναπόθεση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών (BMMSC) απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική λειτουργία [(Runx2, Osterix (Osx), Κολλαγόνο I τύπου 1a (Col1a1)], στην οστεοκλαστική λειτουργία [osteprotegerin (OPG), RANK-Ligand (RANKL), λόγος OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ] καθώς και στην λιπογένεση [Peroxisome-Proliferator-Activated receptor γ (PPARγ)]. Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη RT-PCR. Αποτελέσματα: 1) Τα apoE-/- πειραματόζωα που έλαβαν WTD δεν ανέπτυξαν παχυσαρκία σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD. 2) Στον μυελό των οστών των apoE-/- WTD ποντικιών παρατηρήθηκε πλήρης απουσία λιποκυττάρων, σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD ζώα των οποίων ο μυελός των οστών ήταν πλούσιος σε λιποκύτταρα. 3) Ο αριθμός των οστεοκλαστών ήταν σημαντικά αυξημένος, ενώ των οστεοβλαστών σημαντικά ελαττωμένος στα apoE-/- WTD πειραματόζωα σε σύγκριση με τα C57BL/6 WTD. 4) Η στατική και η δυναμική ιστομορφομετρία έδειξαν ότι τα apoE-/- ποντίκια, σε δίαιτα δυτικού τύπου, εμφάνισαν σημαντική ελάττωση της οστικής τους μάζας. 5) Το δίκτυο του κολλαγόνου στα apoE-/- WTD ποντίκια εμφανίστηκε σημαντικά πιο σκληρό, πιο άκαμπτο και κατά συνέπεια λιγότερο ελαστικό συγκρινόμενο με αυτό των C57BL/6 WTD. 6) Τα apoE-/- WTD ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ρυθμιστή της οστεοβλαστογένεσης Runx2, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, συγκρινόμενα με τα C57BL/6 WTD ζώα. 7) Τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστικής ανακατασκευής RANK και RANKL, ήταν σημαντικά αυξημένα στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD ποντίκια. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της OPG καθώς και η αναλογία OPG/RANKL, ήταν σημαντικά μειωμένα στα apoE-/- WTD ποντίκια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των οστεοκλαστικών ρυθμιστών cathepsin K και TRAP μεταξύ των δύο υπό εξέταση ομάδων ζώων. 8) Ο ρυθμιστής της λιπογένεσης PPARγ, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, ήταν σημαντικά μειωμένος στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD. Συμπεράσματα: 1) Η έλλειψη της apoE εμπλέκεται στην ελάττωση της οστικής μάζας σε ποντίκια υπό δίαιτα δυτικού τύπου 2) Η apoE φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των οστεοβλαστών, ενώ δεν είναι σαφής ο ρόλος της στη λειτουργία των οστεοκλαστών 3) Η έλλειψη της apoE, προστατεύει από την παχυσαρκία αλλά και την εναπόθεση λιποκυττάρων στον μυελό των οστών, κατόπιν λήψεως δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά. 4) Η apoE ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των MSC’s σε ερχόμενο στάδιο, καθώς η έλλειψή της επηρεάζει τόσο την οστεοβλαστική όσο και τη λιποβλαστική διαφοροποίηση, μετά από κατανάλωση δίαιτας δυτικού τύπου, πλούσιας σε λιπαρά.