Ταυτοποίηση του πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον PAR1, μετά την ενεργοποίηση του από την θρομβίνη, και διερεύνηση της βιολογικής δράσης του TR1-41

• Κύριος συγγραφέας: Τσιλιμιδού, Αναστασία
• Άλλοι συγγραφείς: Τσοπάνογλου, Νικόλαος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2008
• Θέματα: Πεπτίδια; Peptides; TR1-41; PAR1; 572.65

Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής ερευνητικής εργασίας αποτελεί η ταυτοποίηση και η διερεύνηση της βιολογικής δράσης του πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον υποδοχέα PAR1 μετά την ενεργοποίηση του από την θρομβίνη. Το υπεύθυνο γονίδιο για την έκφραση του υποδοχέα PAR1 κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μήκους 425 αμινοξέων. Έχει προταθεί ότι τα πρώτα 21-23 αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου του μορίου αυτού πιθανόν να αποτελούν σηματοδοτική αλληλουχία υπεύθυνη για την μεταφορά και τοποθέτηση του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη. Η σηματοδοτική αυτή αλληλουχία είναι άγνωστο προς το παρόν αν παραμένει στον ώριμο PAR1 υποδοχέα ή απομακρύνεται με πρωτεόλυση πριν την εμφάνιση του PAR1 στην κυτταρική μεμβράνη. Ο υποδοχέας PAR1 ανήκει στην μεγάλη οικογένεια υποδοχέων των επτά διαμεμβρανικών τμημάτων (seven transmembrane domain receptor family) που διασυνδέονται με G πρωτεΐνες (G protein-coupled receptors, GPCRs). Επιπλέον, επειδή η ενεργοποίηση του υποδοχέα απαιτεί την ενζυμική δράση της θρομβίνης, ορίζεται με αυτόν τον τρόπο μία νέα οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες (Proteinase-Activated Receptors, PARs). Η θρομβίνη αναγνωρίζει για πέψη μια θέση στην αλληλουχία του εξωκυττατικού αμινοτελικού άκρου μεταξύ των αμινοξέων Arg41-Ser42 του υποδοχέα PAR1. Η πέψη αυτού του πεπτιδικού δεσμού οδηγεί στην απελευθέρωση ενός πεπτιδίου (Thrombin Receptor Peptide, TR) και στην δημιουργία ενός νέου αμινοτελικού άκρου για τον υποδοχέα, που λειτουργεί ως αγωνιστής και ενεργοποιεί τον PAR1. Έχει δειχθεί ότι η θρομβίνη και ο υποδοχέας PAR1 εμπλέκονται σε αρκετές παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Ωστόσο δεν υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες για την δράση του πεπτιδίου που αποκόπτεται. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία HPLC/MS έγινε προσπάθεια για την ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον PAR1 υποδοχέα. Τα πρώτα αποτελέσματα της εφαρμογής αυτής 55 οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι κρίνεται απαραίτητη η περεταίρω βελτίωση των συνθηκών ανίχνευσης του πεπτιδίου, ώστε να επιτρέπεται η ανίχνευση του κατά την φόρτωση 1 ng στην στήλη της υγρής χρωματογραφίας. Πιο συγκεκριμένα η αντιμετώπιση της υψηλής πολικότητας του TR23-41 και η ενίσχυση ευαισθησίας του TR1-41 με την χρήση διαφορετικού διαλύτη ή με την χρήση διαφορετικής στήλης ή και ακόμα ο συνδυασμός διαφορετικού διαλύτη και στήλης, που αποτελεί και την μέχρι τώρα πιο πιθανή εκδοχή αντιμετώπισης των παραπάνω προβλημάτων, πιθανόν να δώσουν λύση στο πρόβλημα ανίχνευσης σε χαμηλές συγκεντρώσεις πεπτιδίου. Επιπλέον με την χρήση τεχνικής ελέγχου DNA σύνθεσης εξετάστηκε η επίδραση του TR1-41 πεπτιδίου σε HUVECs. Σκοπός αυτών των πειραμάτων δεν ήταν μόνο η εύρεση τυχόν βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αλλά και η εύρεση ελάχιστης συγκέντρωσης του πεπτιδίου που προκαλεί αναστολή στην σύνθεση του DNA σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων στις οποίες έχει προηγηθεί συνθήκες νηστείας. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το TR1-41 πεπτίδιο προκαλεί αναστολή στην σύνθεση του DNA και μάλιστα σε ελάχιστη συγκέντρωση 30nM, παρουσία ή μη του αυξητικού παράγοντα VEGF. Μελλοντικές έρευνες με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν να οδηγήσουν στην ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου που αποκόπτεται μετά την τοποθέτηση και ενεργοποίηση του PAR1 στην κυτταρική μεμβράνη και κατ’ επέκταση στην λεπτομερή διερεύνηση της βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αυτού. Γνωρίζοντας την ανάμιξη της θρομβίνης και του υποδοχέα της σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις η ταυτοποίηση του πεπτιδίου και η γνώση της βιολογικής του δράσης μελλοντικά θα αποτελέσει ένα χρήσιμο προγνωστικό και διαγνωστικό δείκτη.