| Περίληψη: | Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε συγκρυστάλλωση ανθρώπινης ινσουλίνης με τέσσερα διαφορετικά φαινολικά παράγωγα, τους οργανικούς προσδέτες m-cresol, 4-nitrophenol, acetylsalicylic acid & 3,5-dihydroxybenzoic acid. Η κρυστάλλωση πραγματοποιήθηκε σε ένα εύρος pH (4.5-8.50), παρουσία ιόντων ψευδαργύρου, ώστε να μελετηθεί η συμπεριφορά των κρυσταλλικών δομών που λαμβάνει η ινσουλίνη συναρτήσει των παραπάνω παραγόντων. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν επιτυχή πειράματα κρυστάλλωσης και παραγωγής πολυκρυσταλλικών δειγμάτων των ιικών πρωτεϊνών, πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie virus B3 καθώς και η επικράτεια μεθυλτρανσφεράσης της μη δομικής πρωτεΐνης 5 του ιού Dengue virus.
Οι κρύσταλλοι που αποκτήθηκαν εκτέθηκαν σε ακτινοβολία ακτινών Χ, χρησιμοποιώντας όργανα υψηλής ευκρίνειας στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF της Γαλλίας, στο Ελβετικό σύγχροτρον, SLS, ενώ πολυάριθμα πειράματα διεξήχθησαν και στις εγκαταστάσεις του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών (Ερευνητικό Χώρος: Υ31) στα εκεί ευρισκόμενα εργαστηριακά περιθλασίμετρα. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ήταν αυτή της περίθλασης ακτινοβολίας από πολυκρυσταλλικά υλικά (powder diffraction), η οποία αποδεικνύει σταθερά τα τελευταία χρόνια την αξιοπιστία και αποδοτικότητα της στον τομέα του δομικού χαρακτηρισμού βιολογικών μακρομορίων καθώς και της ενδελεχούς μελέτης των αλληλεπιδράσεων τους με άλλα μόρια, αμφότερες πληροφορίες ανεκτίμητες στην κατεύθυνση της βελτιστοποίησης και σχεδιασμού νέων φαρμακευτικών σκευασμάτων.
Τα δεδομένα περίθλασης επεξεργάστηκαν με ειδικά πακέτα ανάλυσης δεδομένων προκειμένου να επιτευχθεί δομικός χαρακτηρισμός των κρυστάλλων που προέκυψαν σε επίπεδο συμμετρίας και διαστάσεων της μοναδιαίας κυψελίδας. Συνοπτικά, εξήχθησαν τα παρακάτω αποτελέσματα:
Για τα δείγματα ινσουλίνης που περιείχαν τους προσδέτες m-cresol & 4-nitrophenol
Σε όξινο περιβάλλον (pH: 4.74 - 6.50) αναφέρουμε την εμφάνιση μιας νέας, μη καταγεγραμμένης ως τώρα, κρυσταλλικής φάσης της ινσουλίνης μονοκλινούς συμμετρίας (space group: P21, πλεγματικές σταθερές a = 87.0749(7) Å, b = 70.1190(5) Å, c = 48.1679(5) Å, β = 106.7442(8)˚). Σε αλκαλικό περιβάλλον (pH: 7.25 – 8.50) εντοπίζεται το space group: R3, με δύο διαφορετικές διαμορφώσεις για τα μόρια της ινσουλίνης’ R6 διαμόρφωση, με πλεγματικές σταθερές a = b = 80.0644(6) Å, c = 40.8396(3) Å, γ = 120.000˚, για τα δείγματα έχοντα ως προσδέτη το μόριο m-cresol και διαμόρφωση T3R3f με πλεγματικές σταθερές a = b = 80.721(1) Å, c = 37.8039(5) Å, γ = 120.000˚, για τα δείγματα 4-nitrophenol.
Για τα δείγματα ινσουλίνης που περιείχαν τους προσδέτες acetylsalicylic acid & 3,5-dihydroxybenzoic acid
Σε ελαφρά όξινο περιβάλλον (pH: 5.45 έως 6.6) εντοπίζεται το space group: R3, με διαμόρφωση για τα μόρια της ινσουλίνης’ T6, με πλεγματικές σταθερές a = b = 82.9773(5) Å, c = 33.9893(1) Å, γ = 120.0000˚, για τα δείγματα έχοντα ως προσδέτη οποιοδήποτε από τα 2 μόρια. Σε ελαφρά αλκαλικό περιβάλλον (pH: 7.00 – 8.2) εντοπίζεται εκ νέου το space group: R3, αυτή την φορά όμως η διαμόρφωση των μορίων είναι της μορφής T3R3f με πλεγματικές σταθερές a = b = 80.6563(7) Å, c = 37.6813(2) Å, γ = 120.0000˚, για τα δείγματα και των δύο προσδετών. Αναφέρουμε πως είναι η πρώτη καταγεγραμμένη συγκρυστάλλωση των μορίων acetylsalicylic acid & 3,5-dihydroxybenzoic acid με την ινσουλίνη.
Για τα δείγματα ιικών πρωτεϊνών (πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie virus B3 καθώς και η επικράτεια μεθυλτρανσφεράσης της μη δομικής πρωτεΐνης 5 του ιού Dengue virus)
Αναφέρουμε την πρώτη επιτυχή παραγωγή πολυκρυσταλλικών δειγμάτων από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες καθώς και την συλλογή ποιοτικών δεδομένων περίθλασης. Στα δείγματα πρωτεάσης 3C εντοπίσθηκε το space group C 1 2 1 (συμμετρία μονοκλινής) με πλεγματικές σταθερές a = 77.920(3) Å b = 65.729(2) Å, c = 40.614(3) Å, β = 115.915(4)˚, ενώ στα δείγματα της μεθυλτρανσφεράσης ταυτοποιήθηκε το space group P 21 21 2 (συμμετρία ορθορομβική) με πλεγματικές σταθερές a = 189.594(1) Å b = 61.897(1) Å, c = 52.4153(3) Å.
Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η αναπαραξιμότητα των δεδομένων και η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε τόσο μεγάλος αριθμός πειραμάτων κρυστάλλωσης όσο και πολυάριθμες συλλογές δεδομένων στις προαναφερθείσες εγκαταστάσεις.
Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι διπλός καθώς μέσω αυτής είναι επιθυμητή τόσο η εξαγωγή αξιοποιήσιμων στον κλάδο του σχεδιασμού φαρμάκων, δεδομένων όσο και η πιστοποίηση της αποδοτικότητας της τεχνικής Powder Diffraction σε βιολογικά μακρομόρια με απώτερο σκοπό την περαιτέρω προώθησή της.
|
|---|
