Μελέτη των μοριακών μηχανισμών ανάπτυξης του οφθαλμικού πτερυγίου στον άνθρωπο : ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α, της πρωτεΐνης pVHL και των πρωτεΐνών θερμικού σοκ

• Κύριος συγγραφέας: Παγουλάτος, Διονύσιος
• Άλλοι συγγραφείς: Ασημακοπούλου, Μάρθα
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2015
• Θέματα: Οφθαλμικά πτερύγια; Υποξία; Πρωτεΐνες θερμικού σοκ; Ocular pterygiums; Hypoxia; HIF-1α; pVHL; HSPs; 617.77

Η υποξία επάγει αύξηση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), ο οποίος είναι γνωστό ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων καθώς και στην επιβίωση των αρχέγονων κυττάρων (stem cells). Σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου η πρωτεΐνη von Hippel Lindau (pVHL) διατηρεί τα επίπεδα της δραστικότητας του HIF-1α χαμηλά. Επιπλέον, πολλά είναι τα ερευνητικά δεδομένα που αποκαλύπτουν τη συνεργασία των οδών ρύθμισης των επιπέδων του οξυγόνου και της έκφρασης των πρωτεϊνών θερμικού σοκ (Heat shock proteins), οι οποίες συμβάλλουν στην προσαρμογή των κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες. Το οφθαλμικό πτερύγιο θεωρείται ότι είναι μια εξεργασία που προέρχεται από τα αρχέγονα κύτταρα του επιπεφυκότα στην περιοχή του σκληροκερατοειδικού ορίου, εμφανίζει προκαρκινικά χαρακτηριστικά και για το οποίο έχει αναφερθεί ότι χαρακτηρίζεται από υποξικό μικροπεριβάλλον. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει την συν-έκφραση του παράγοντα μεταγραφής Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) και της πρωτεΐνης von Hippel Lindau (pVHL), στο οφθαλμικό πτερύγιο σε σύγκριση με τον φυσιολογικό επιπεφυκότα του ανθρώπου. Επιπροσθέτως, ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών θερμικού σοκ (Hsp90, Hsp70, Hsp27). Δόθηκε έμφαση στην ταυτοποίηση της συν-έκφρασης του HIF-1α και της Hsp90, η οποία, σύμφωνα με προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα, συνδέεται και σταθεροποιεί τον HIF-1α με αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφικής του δραστηριότητας. Για την τοπογραφική ανίχνευση των HIF-1α, pVHL, Hsp90, Hsp70, και Hsp27 χρησιμοποιήθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος, σε τομές ιστού πάχους 4μm, εγκλεισμένου σε παραφίνη από δείγματα πτερυγίου και φυσιολογικού επιπεφυκότα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σε εκχυλίσματα ιστού με τη μέθοδο Western blot. Η συν-έκφραση των πρωτεϊνών μελετήθηκε με την εφαρμογή της μεθόδου του διπλού ανοσοφθορισμού. Στις παραπάνω πειραματικές διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα έναντι των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Στατιστικά σημαντική αυξημένη έκφραση του HIF-1α και των Hsps (Hsp90, Hsp70 και Hsp27) βρέθηκε στα πτερύγια σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς επιπεφυκότες (p<0.05). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση της pVHL στα πτερύγια σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς επιπεφυκότες (p≥0.05). Πυρηνική ανοσοεντόπιση του HIF-1α παρατηρήθηκε σε όλα τα επιθηλιακά στρώματα σε 23 από τα 32 (71,8%) πτερύγια που μελετήθηκαν. Επιπλέον, σε όλα τα επιθηλιακά στρώματα της πλειοψηφίας των δειγμάτων των πτερυγίων (75%) υπήρξε ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για τη Hsp27 ενώ έκφραση της Hsp27 ανιχνεύθηκε σε όλα τα πτερύγια (100%) που μελετήθηκαν. Έκφραση της Ηsp27 δεν παρατηρήθηκε στο επιφανειακό στρώμα των καλυκοειδών κυττάρων. Σε ορισμένα δείγματα, μικρός πληθυσμός των κυττάρων της βασικής επιθηλιακής στιβάδας εμφάνισε ασθενή ή αρνητική έκφραση για τη Hsp27. Η ανοσοδραστικότητα της φωσφορυλιωμένης Hsp27 είχε το ίδιο πρότυπο κατανομής όπως και η Hsp27. Στο επιθήλιο όλων των πτερυγίων (100%) παρατηρήθηκε μέτρια έως ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για τη Hsp90. Επιπλέον, στην πλειοψηφία των πτερυγίων και συγκεκριμένα σε 30/32 (93,7%) και 27/32 (84,3%) πτερύγια βρέθηκε κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για τη Hsp70 και τη pVHL, αντιστοίχως. Η ανοσοδραστικότητα για τη Hsp90, τη Hsp70 και τη pVHL ανιχνεύθηκε κυρίως στα κύτταρα της βασικής και υπερβασικής επιθηλιακής στιβάδας. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όμως, παρατηρήθηκε ισχυρή ανοσοδραστικότητα σε όλα τα επιθηλιακά στρώματα. Στο τοίχωμα των αγγείων του στρώματος ανιχνεύθηκε έκφραση για τις Hsps (Hsp90, Hsp70 και Hsp27) και τη pVHL. Η στατιστική ανάλυση έδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του HIF-1α και των επιπέδων έκφρασης των Hsps (Hsp90, Hsp70 και Hsp27) (p<0.05). Η έκφραση του HIF-1α δεν συσχετίστηκε με την έκφραση της pVHL (p≥0.05). Με τα πειράματα διπλής χρώσης ανοσοφθορισμού ταυτοποιήθηκε πυρηνική ανοσοεντόπιση του HIF-1α με ταυτόχρονη κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 σε κύτταρα κατανεμημένα σε όλο το εύρος του επιθηλίου των πτερυγίων, σε αντίθεση με τους φυσιολογικούς επιπεφυκότες, όπου σε μόνο λίγα διάσπαρτα επιθηλιακά κύτταρα βρέθηκε κυτταροπλασματική έκφραση του HIF-1α και, στη βασική κυρίως στιβάδα, κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι η συντονισμένη ρύθμιση της ενεργοποίησης του HIF-1α και των Hsps στο πτερύγιο μπορεί να αντιπροσωπεύει μία προσαρμοστική διαδικασία για την επιβίωση των κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες. Η σημασία της σύνδεσης της Hsp90 με τον HIF-1α, με στόχο μία νέα θεραπευτική προσέγγιση του πτερυγίου, απαιτεί περαιτέρω λειτουργικές μελέτες.