Στόχευση των πεπτιδίων αμυλοειδούς ή/και του αιματεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ) με διάφορους τύπους νανολιποσωμάτων με σκοπό την ανάπτυξη νανοφαρμάκων για την [sic] νόσο του Alzheimer

• Κύριος συγγραφέας: Μαρκουτσά, Ελένη
• Άλλοι συγγραφείς: Αντιμησιάρη, Σοφία
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2016
• Θέματα: Λιποσώματα; Νόσος Alzheimer; Liposomes; Alzheimer disease; 616.831 061

Τα πεπτίδια και οι πλάκες αμυλοειδούς είναι οι κύριοι στόχοι για τη θεραπεία ή /και τη διάγνωση της νόσου του Alzheimer (ΝΑ). Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στην έρευνα για νανοσωματίδια που φέρουν πρoσδέτες για τα Αβ πεπτίδια και έχουν διερευνηθεί για διαγνωστικούς αλλά και θεραπευτικούς σκοπούς. Η διαπέραση αυτών των νανοφορέων στον εγκέφαλο όπως και πολλών φαρμάκων περεμποδίζεται από τα ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΒΒΒ). Έχουν προταθεί αρκετές μη-επεμβατικές προσεγγίσεις για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, όπως η ανάπτυξη ειδικών νανοσυστημάτων στόχευσης, τα οποία μπορούν να ενδοκυτταρώνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου μέσω υποδοχέων που υπερεκφράζονται σε αυτά (με την προϋπόθεση ότι η επιφάνεια των νανοφορέων είναι επικαλυμμένη με πρωτεΐνες/αντισώματα ή αλλά μόρια που προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς). Παρασκευάστηκαν πολυλειτουργικά λιποσώματα με την πρόσδεση στην επιφάνειά τους είτε αντισώματος έναντι του υποδοχέα της τρανσφερίνης (anti-TfR [OX26 ή RI7217)] είτε αντισώματος ή άλλων μορίων που έχουν υψηλή συγγένεια για τα Αβ αμυλοειδή πεπτίδια. Πιο συγκεκριμένα για την στόχευση στα Αβ αμυλοειδή προσδέθηκαν στην επιφάνεια των λιποσωμάτων είτε αντίσωμα mAb έναντι των Αβ-πεπτιδίων (Αβ-MAb) είτε δύο διαφορετικά λιπιδικά παράγωγα κουρκουμίνης. Ελέχθηκαν τρείς διαφορετικοί μέθοδοι πρόσδεσης αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Δύο μέθοδοι που βασίζονται στην αλληλεπίδραση Βιοτίνης/Στρεπταβιδίνης και μια μέθοδος που βασίζεται στο σχηματισμό ομοιοπολικού δεσμού θειοαιθέρα για την πρόσδεση του αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Όλοι οι τύποι λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν χαρακτηρίστηκαν ως προς την κατανομή μεγέθους, το ζ-δυναμικό, τη μορφολογία και τη σταθερότητά τους κατά τη διάρκεια επώασης παρουσία πρωτεϊνών ορού. Τα λιποσώματα σημάνθηκαν με υδρόφιλες (καλσεΐνης ή FITC-δεξτράνη) και / ή υδρόφοβες (ροδαμίνη-λιπιδίου, DIR) χρωστικές, ώστε να είναι δυνατή ο εντοπισμός και η μέτρηση των λιποσωμάτων στα διάφορες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν. Χρησιμοποιήθηκαν αθανατοποιημένα ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (hCMEC/D3) ως κυτταρικό μοντέλο του ΑΕΦ, για τις μελέτες πρόσληψης και μεταφοράς των λιποσωμάτων κατά μήκος του ΑΕΦ. Η στόχευση στον εγκέφαλο μελετήθηκε Ιn Vivo με τη χορήγηση λιποσωμάτων που φέρουν τη χρωστική DiR που ακολουθήθηκε από ex-vivo απεικόνιση των οργάνων. Μελετήθηκαν επίσης λιποσώματα που φέρουν ειδικούς προσδέτες, με υψηλή συγγένεια για τα Αβ αμυλοειδή, ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν ή να καθυστερούν τη συσσωμάτωση των Αβ πεπτιδίων αλλά και ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν την επαγόμενη από τα αμυλοειδή (και Ζη, ή αμυλοειδές + Ζη) κυτταροτοξικότητα, επί των κυττάρων νευροβλαστώματος άγριου τύπου (N2aWT) καθώς και των μετασχηματισμένων κυττάρων νευροβλαστώματος (N2aAPP). Η αιμοσυμβατότητα όλων των τύπων λιποσωμάτων προηγήθηκε της In Vivo μελέτης. Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα δείχνουν και οι τρεις μέθοδοι πρόσδεσης αντισώματος που χρησιμοποιήθηκαν, είχαν ως αποτέλεσμα την παρασκευή λιποσωμάτων με μικρό μέγεθος (μέσης διαμέτρου περίπου 150 nm), χαμηλής πολυ-διασποράς (περ. ~ 0.20) και παρόμοιας απόδοσης πρόσδεσης αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων (65-85%). Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η κυτταρική σειρά hCMEC/D3 είναι ένα καλό μοντέλο για τον Ιn Vitro έλεγχο της διαπέρασης νανοσωματιδίων κατά μήκος του ΑΕΦ. Η πρόσληψη και η διαπέραση των ανοσολιποσωμάτων, όπως αυτή υπολογίστηκε με βάση τις λιποσωμικές χρωστικές, ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με των λιποσωμάτων ελέγχου (για κάθε περίπτωση). Η πρόσδεση και δεύτερου μη-ειδικού αντισώματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων μειώνει ελαφρώς την κυτταρική πρόσληψη των ΟΧ-26-λιποσωμάτων. In-vivo και ex-vivo αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την αυξημένη ικανότητα στόχευσης των ανοσολιποσωμάτων στον εγκέφαλο σε σύγκριση με τα λιποσώματα ελέγχου. Τα In Vivo και Ex Vivo αποτελέσματα ήταν σε καλή συμφωνία με τις In Vitro μελέτες στόχευσης που βασίστηκαν στη χρήση του κυτταρικού μοντέλου του ΑΕΦ hCMEC/D3. H πρόσληψη των Αβ mAb λιποσωμάτων ήταν υψηλότερη από αυτή των πεγκυλιωμένων λιποσωμάτων ελέγχου, ενώ η κυτταρική πρόσληψη των ΑβmAb-λιποσωμάτων αυξήθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με Αβ 1-42 πεπτίδια. Η διαπέραση των ΑβmAb-λιποσωμάτων μέσω των κυτταρικών μονοστιβάδων ήταν 2.5 φορές υψηλότερη όταν τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με πεπτίδια Αβ 1-42. Η μεταφορά των δύο λιποσωμικών χρωστικών, FITC και Ροδαμίνης, ήταν ισοδύναμη, υποδεικνύοντας ότι τα ΑβmAb-λιποσώματα μεταφέρονται άθικτα μέσω του κυτταρικού μοντέλου του ΑΕΦ. Η επαγόμενη από το πεπτίδιο Αβ αύξηση στην κυτταρική πρόσληψη και διαπέραση των Αβ mAb- λιποσωμάτων οφείλεται κυρίως στην παρουσία των υποδοχέων των Αβ (RAGE), όπως αποδεδείχθηκε μετά από μπλοκάρισμα του RAGE από ειδικό anti-RAGE μονοκλωνικό αντίσωμα. Η παρουσία των Αβ πεπτιδίων δεν επηρέασε την ακεραιότητα των κυτταρικών μονοστιβάδων των ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς αποδείχθηκε ότι η διαενδοθηλιακή αντίσταση και η διαπερατότητα του Lucifer Yellow (που είναι μοντέλο παρακυττάριας διαπέρασης) δεν επηρεάστηκαν. Επιπλέον, η βιωσιμότητα των κυττάρων hCMEC/D3 δεν επηρεάστηκε από την παρουσία των Αβ πεπτιδίων ή των Αβ mAb-λιποσωμάτων. Η κυτταρική πρόσληψη των πολυλειτουργικών λιποσωμάτων, που φέρουν ΟΧ-26 και αντι-Aβ αντίσωμα προσδεδεμένο στην επιφάνειά τους, αυξήθηκε σημαντικά όταν τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με Αβ 1-42 πεπτίδια. Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι όλοι οι τύποι των λιποσωμάτων που φέρουν προσδεδεμένα αντισώματα η λιπιδικά παράγωγα κουρκουμίνης καθυστερούν σημαντικά τη συσσωμάτωση των πεπτιδίων αμυλοειδούς. Ωστόσο, αν και Αβ-MAb-λιποσώματα ανέστειλαν σημαντικά την επαγόμενη από τα αμυλοειδή κυτταροτοξικότητα σε όλες τις περιπτώσεις, οι δύο τύποι λιποσωμάτων που φέρουν τα λιπιδικά παράγωγα κουρκουμίνης δεν ανέστειλαν την επαγόμενη από ψευδάργυρο ή από ψευδάργυρο σε συνδυασμό με Αβ πεπτίδια κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα N2aWT, υποδηλώνοντας χαμηλότερη δραστικότητα των συγκεκριμένων λιποσωμικών μορφών έναντι των συνθετικών Αβ πεπτιδίων (σε σύγκριση με το ενδογενή πεπτίδια Αβ) ίσως λόγω διαφορετικής συγγένειας προς τις διαφορετικές μορφές (στάδια συσσωμάτωσης ειδών) του πεπτιδίου (μονομερή, ολιγομερή, ινίδια, κλπ). Οι μελέτες αιμοσυμβατότητας έδειξαν ότι όλοι οι τύποι λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν είναι συμβατοί και μη-τοξικοί ως προς το αίμα, καθώς δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση ούτε στην ενεργοποίηση του συστήματος συμπληρώματος (CS5b9, Ci3b), ούτε στη διαδικασία πήξης και στην αιμόλυση σε ανθρώπινο ορό. Συμπεράσματα Τα πολυλειτουργικά λιποσώματα που αναπτύχθηκε μπορεί να αποτελέσουν πιθανά διαγνωστικά ή/και θεραπευτικά εργαλεία για τη νόσο του Alzheimer καθώς φέρουν αντίσωμα που τα καθιστά ικανά να διαπερνούν τον ΑΕΦ και προσδέτες για στόχευση στα αμυλοειδή ή τις πλάκες αμυλοειδούς που είναι και η κύρια αιτία της παθολογίας της ΝΑ.