| Περίληψη: | Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον τόσο για τη βασική έρευνα όσο και για ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε συγκριτικά η ικανότητα ετερότροφων και αυτότροφων μικροοργανισμών να συσσωρεύουν λιπίδια. Η αύξηση των ελαιογόνων μικροοργανισμών και η ελαιογένεση περιγράφηκε και με τη χρήση μαθηματικών προτύπων.
Ως ετερότροφοι μικροοργανισμοί μελετήθηκαν η ζύμη Yarrowia lipolytica και οι Ζυγομύκητες Thamnidium elegans και Zygorhynchus moelleri. Οι Ζυγομύκητες καλλιεργούμενοι σε θρεπτικό μέσο που περιείχε ως πηγή άνθρακα γλυκόζη ή γλυκόζη σε συνδυασμό με υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (OMW) ή μόνο OMW, απεδείχθη ότι ακολουθούν το τυπικό πρότυπο ελαιογένεσης αφού υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο και αφθονίας της πηγής άνθρακα συσσώρευσαν λιπίδια, ενώ μετά την εξάντληση της πηγής άνθρακα αποδόμησαν τα ενδοκυτταρικά λιπίδια προς παραγωγή ενέργειας συντήρησης. Η ανωτέρω βιομετατροπή των σακχάρων σε μικροβιακό λίπος περιγράφηκε επιτυχώς με τη χρήση μαθηματικών προτύπων και προσδιορίστηκαν οι ειδικοί ρυθμοί αύξησης, καθώς επίσης και οι αποδόσεις βιομάζας και λιπιδίων.
Από το ανωτέρω πρότυπο ελαιογένεσης διαφοροποιείται η ελαιογόνος ζύμη Y. lipolytica. Η Y. lipolytica μελετήθηκε καλλιεργούμενη επί γλυκερόλης σε θρεπτικά υλικά περιοριστικά ως προς το άζωτο προκειμένου να ελεγχθεί ο μεταβολισμός της γλυκερόλης προς λιπίδια ή/και κιτρικό οξύ. Τα θρεπτικά υλικά που επιλέχθηκαν περιείχαν είτε αποκλειστικά ως πηγή αζώτου οργανικά συστατικά (εκχύλισμα ζύμης - ΥΕ, εκχύλισμα τομάτας), είτε συνδυασμό ανόργανης και οργανικής πηγής αζώτου ((NH4)2SO4 και ΥΕ). H σύνθεση βιομάζας και η συσσώρευση λιπιδίων ευνοήθηκαν όταν η ζύμη καλλιεργήθηκε σε οργανικές πηγές αζώτου και συγκεκριμένα παρουσία ΥΕ, αφού παράχθηκαν 10,3 g/l βιομάζας και 17,7% w/w λιπίδια επί της ξηρής βιομάζας. Η βιοχημική συμπεριφορά της ζύμης και η ικανότητά της να βιοσυνθέτει λιπίδια μελετήθηκε περαιτέρω υπό το πρίσμα της επίδρασης της συγκέντρωσης του ΥΕ, που ήταν ο περιοριστικός για την αύξηση παράγοντας, σε καλλιέργειες της ζύμης σε συνεχές σύστημα με ειδικό ρυθμό αραίωσης D= 0,028 1/h επί γλυκερόλης και με ποικίλες αρχικές συγκεντρώσεις ΥΕ (2 - 5 g/l). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέγιστη συσσώρευση λιπιδίων (10,9% w/w επί της ξηρής βιομάζας) παρατηρήθηκε όταν το YE ήταν 3 g/l. Η συσσώρευση των λιπιδίων ωστόσο αυξήθηκε περαιτέρω (16,7% w/w επί της ξηρής βιομάζας) όταν πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια της ζύμης σε μέσο που ήταν περιοριστικό συγχρόνως σε άζωτο και μαγνήσιο και παρουσία χαμηλότερης αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης (50 g/l), ενώ μεγιστοποιήθηκε (23,5% w/w επί της ξηρής βιομάζας) όταν η ζύμη καλλιεργήθηκε σε μέσο με χαμηλή αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης (10 g/l) απουσία μαγνησίου και παρουσία χαμηλής συγκέντρωσης αζώτου, και το οποίο εμπλουτιζόταν περιοδικά με γλυκερόλη και ΥΕ ή μόνο με γλυκερόλη. Όταν η ικανότητα της ζύμης να συσσωρεύει λιπίδια μελετήθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου (DO), παρατηρήθηκε ότι σε υψηλή συγκέντρωση DO η ζύμη συσσώρευσε ελαφρώς περισσότερα λιπίδια σε σχέση με τις καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν σε χαμηλό DO. Ωστόσο, η συγκέντρωση του DO επηρέασε τη μορφολογία της ζύμης αφού σε υψηλό DO επικρατούσαν μεμονωμένα κύτταρα, ενώ σε χαμηλό η καλλιέργεια αποτελούνταν κυρίως από αληθή μυκήλια. Αποδείχθηκε ότι η συγκέντρωση του DO είναι η κρίσιμη παράμετρος η οποία επηρεάζει τη μορφολογία της ζύμης ανεξάρτητα της φύσης και της συγκέντρωσης των πηγών άνθρακα και αζώτου.
Στις συνθήκες που παρατηρήθηκε σημαντική βιοσύνθεση λιπιδίων η ενεργότητα του ενζύμου ΑΤΡ-κιτρική λυάση (ATP:CL) (το οποίο εμπλέκεται στη βιοσύνθεση ακετυλο-CoA, προδρόμου των αλειφατικών ενώσεων μεγάλου μοριακού βάρους) ήταν υψηλή, ενώ η ενεργότητα της NAD-εξαρτώμενης ισοκιτρικής αφυδρογονάσης (ICDH) (το οποίο συμμετέχει στην αφομοίωση του κιτρικού οξέος μέσω του κύκλου Krebs) ήταν χαμηλή έως μηδενική. Οι συνθήκες αυτές σύμφωνα με τα μέχρι πρότινος δεδομένα δημιουργούν ευνοϊκές συνθήκες ελαιογένεσης. Ωστόσο, οι σχετικά χαμηλές τιμές ενεργότητας του μηλικού ενζύμου (ΜΕ), το οποίο συμμετέχει στην παραγωγή αναγωγικής δύναμης NADPH, συνένζυμο που είναι απαραίτητο για τη βιοσύνθεση των αλειφατικών αλυσίδων, υποδεικνύουν ότι το ΜΕ ενδεχομένως δεν εμπλέκεται στη διαδικασία ελαιογένεσης στη ζύμη Y. lipolytica, και ότι το απαιτούμενο NADPH παρέχεται από εναλλακτική πηγή. Οι ενεργότητες των ενζύμων κινάση της γλυκερόλης (GK) και αφυδρογονάση της γλυκερόλης (GD), τα οποία συμμετέχουν στην αφομοίωση της γλυκερόλης, αυξήθηκαν αυξανομένης της συγκέντρωσης του ΥΕ, καθιστώντας τη γλυκερόλη διαθέσιμη τόσο για τις κοινές αναβολικές δραστηριότητες (σύνθεση κυτταρικής μάζας) όσο και για τη βιοσύνθεση μεταβολιτών όπως τα λιπίδια.
Τα λιπίδια της ζύμης αποτελούνταν κατά κύριο λόγο από ουδέτερα λιπίδια (NL) ακολουθούμενα από τα φωσφολιπίδια (P) και τα γλυκο- και σφιγγο-λιπίδια (G+S). Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs) ήταν κατά κύριο λόγο εστεροποιημένα στα P γεγονός που υποδηλώνει ότι η διακίνηση τους και προς τα υπόλοιπα κλάσματα δεν ήταν αποτελεσματική.
Τη συσσώρευση λιπιδίων στα κύτταρα της Yarrowia lipolytica ακολούθησε αποδόμησή τους, ακόμη και όταν η πηγή άνθρακα βρισκόταν στο περιβάλλον της αύξησης σε υψηλές συγκεντρώσεις, χαρακτηριστικό μοναδικό της ζύμης Y. lipolytica που τη διαφοροποιεί ουσιαστικά από τους τυπικούς ελαιογόνους μικροοργανισμούς. Η συμπεριφορά αυτή ενδεχομένως υποδεικνύει χαμηλό ρυθμό αφομοίωσης της πηγής άνθρακα με αποτέλεσμα την αδυναμία κάλυψης των αναβολικών δραστηριοτήτων του κυττάρου.
Tα μικροφύκη Chlorella sp. και Nannochloropsis salina καλλιεργούμενα σε φωτοβιοαντιδραστήρα τύπου ανοιχτής δεξαμενής παρήγαγαν 350-500 mg/l βιομάζας που περιείχε λιπίδια σε ποσοστό 40% και 16% w/w επί της ξηρής βιομάζας, αντίστοιχα, και έως 35,9% σάκχαρα. Τα αποθεματικά αυτά υλικά (πολυσακχαρίτες και λιπίδια) αποδομήθηκαν όταν η πυκνότητα της καλλιέργειας έφτασε μια μέγιστη τιμή οπότε και δημιουργήθηκαν συνθήκες πενίας άνθρακα και ενέργειας (παρεχόμενα από το CO2 και τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης), αφού το φως δεν μπορούσε να εισχωρήσει στην υψηλής πυκνότητας καλλιέργεια. Η παρουσία ενζύμων, όπως τα ATP:CL και ΜΕ, τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη διαδικασία της ελαιογένεσης των ετερότροφων ελαιογόνων μικροοργανισμών, αναφέρθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη. Τα ένζυμα αυτά προσδιορίστηκαν μετρώντας τις αντίστοιχες ενεργότητες, και έτσι αποσαφηνίστηκαν περαιτέρω οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των λιπιδίων στους αυτότροφους μικροοργανισμούς. Η υψηλή ενεργότητα της ATP:CL σε συνδυασμό με τη χαμηλή ή και μηδενική ενεργότητα της ICDH υποδεικνύουν ότι τα μικροφύκη μπορούν να βιοσυνθέτουν ακετυλο-CoA και μέσω του κιτρικού. Ωστόσο, η ικανότητα τους να βιοσυνθέτουν λιπίδια φαίνεται να περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη χαμηλή ενεργότητα του ME το οποίο συμμετέχει στην παραγωγή αναγωγικής δύναμης NADPH η οποία είναι απαραίτητη για τη βιοσύνθεση των αλειφατικών αλυσίδων. Εναλλακτικά, ενδέχεται το απαιτούμενο NADPH να παρέχεται από εναλλακτικές πηγές (π.χ. μέσω της φωτοσύνθεσης ή της καταβολικής οδού των φωσφοροπεντοζών). Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με την αμφιλεγόμενη συμμετοχή του ΜΕ στη διαδικασία ελαιογένεσης σε μερικούς, τουλάχιστον, ετερότροφους μικροοργανισμούς (όπως στην περίπτωση της ζύμης Y. lipolytica), θέτει ερωτήματα για την καθολικότητα του βιοχημικού προτύπου που χρησιμοποιείται για την μελέτη των ελαιογόνων μικροοργανισμών. Επιπλέον, στα υπό μελέτη μικροφύκη παρατηρήθηκε κατανάλωση των αποθεματικών πολυσακχαριτών με παράλληλη αύξηση της συσσώρευσης των λιπιδίων, υποδεικνύοντας βιομετατροπή των σακχάρων σε λιπίδια. Από τα αποτελέσματα αυτά συμπεραίνεται ότι η βιοσύνθεση των λιπιδίων είναι διαδικασία ανταγωνιστική αυτής της βιοσύνθεσης πολυσακχαριτών.
Στα λιπίδια των μικροφυκών το κλάσμα των G+S ήταν το υπερέχον επί των ολικών λιπιδίων. Τα PUFAs βρέθηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις και στα δυο μικροφύκη και τα οποία ήταν εστεροποιημένα κυρίως στο κλάσμα των G+S.
Τα ευρήματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συμβάλλουν στην κατανόηση της βιοσύνθεσης των λιπιδίων από τους ελαιογόνους μικροοργανισμούς και διασαφηνίζουν πτυχές της βιοχημείας ελαιογένεσης. Η βιοχημική διαφοροποίηση της ζύμης Yarrowia lipolytica από τους τυπικούς ελαιογόνους μικροοργανισμούς, αλλά και οι ιδιομορφίες των μηχανισμών που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των λιπιδίων στα αυτότροφα ελαιογόνα μικροφύκη (Chlorella sp. και Nannochloropsis salina), υποδεικνύουν ότι η διαδικασία συσσώρευσης λιπιδίων διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ των ελαιογόνων μικροοργανισμών και επομένως σημαντική έρευνα υπολείπεται προς πλήρη διευκρίνιση των μηχανισμών ελαιογένεσης.
|
|---|
