Παρασκευή, απομόνωση και σχέση δομής-δραστικότητας ιικών macro τομέων, μέσω φασματοσκοπίας NMR

• Κύριος συγγραφέας: Ντόντη, Διώνη-Ελένη
• Άλλοι συγγραφείς: Σπυρούλιας, Γεώργιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2016
• Θέματα: Φασματοσκοπία NMR; Έκφραση πρωτεϊνών; Macro τομείς; Δομική ιολογία; NMR spectroscopy; Protein expression; Macro domains; Structural virology; 579.2

Οι «macro» τομείς καταλαμβάνουν αλληλουχίες 130-190 αμινοξέων παρουσιάζοντας υψηλά ποσοστά συντήρησης σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, βακτήρια, ιούς και αρχαία επιδεικνύοντας συμμετοχή σε σημαντικές βιολογικές λειτουργίες. Εξετάζοντας τους macro τομείς ιών, κυρίως εντοπίζονται στις μη-δομικές πρωτεΐνες ιών με θετικό μονόκλωνο RNA, συμπεριλαμβανομένου των Αλφαϊών, των Κορονοϊών και των ιών του γένους Hepevirus. Εκτεταμένη έρευνα έχει αποδείξει πως οι συγκεκριμένοι τομείς συνδέονται με μεταβολίτες του NAD+, συμπεριλαμβάνοντας την ADP-ριβόζη καθώς και την πολυ-ADP-ριβόζη. Η σύνδεση αυτή εμπλέκεται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως η αντιγραφή του ιικού γονιδιώματος στο κύτταρο ξενιστή, αν και η ακριβής λειτουργία τους χρήζει περαιτέρω μελέτης. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιώντας μεθόδους Μοριακής Βιολογίας σε συνδυασμό με τη Φασματοσκοποία NMR διερευνώνται οι διαμορφωτικές και λειτουργικές ιδιότητες δύο macro τομέων: (α) ο τομέας του ιού της Εγκεφαλίτιδας Ιπποειδών της Βενεζουέλας (Venezuelan Equine Encephalitis Virus) και β) ο τομέας του ιού της Ηπατίτιδας Ε (Hepatitis E Virus). Οι macro τομείς παρουσιάζουν υψηλή συντήρηση ανάμεσα σε εκπροσώπους του γένους των Αλφαϊών (Alphavirus) και ο ιός της Εγκεφαλίτιδας Ιπποειδών της Βενεζουέλας (Venezuelan Equine Encephalitis Virus, VEEV) συνιστά μέλος αυτού του γένους, ανήκοντας στους ιούς του Νέου Κόσμου (New World). Ο ιός εντοπίζεται κυρίως στην Βόρεια, Κεντρική και Νότια Αμερική, προκαλώντας σφοδρές εγκεφαλίτιδες σε ιπποειδή και ανθρώπους που μολύνονται από τον ιό μέσα από το τσίμπημα κουνουπιών που φέρουν τον ιό. Ο ιός εντοπίζεται στην μη δομική πρωτεΐνη 3 (nsp3) στο γονιδίωμα του ιού και αποτελείται από 160 αμινοξέα. Από την άλλη πλευρά, ο ιός της Ηπατίτιδας Ε (Hepatitis E virus, HEV), ανήκει στο γένος Hepevirus και αποτελεί τον γενεσιουργό παράγοντα της ηπατίτιδας Ε, ενδημική σε αναπτυσσόμενες χώρες. Ο ιός μεταδίδεται μέσω της από του στόματος οδού, εξαιτίας μολυσμένων υδάτων προκαλώντας οξεία ηπατική ανεπάρκεια. Ο macro τομέας του ΗEV εντοπίζεται στο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης 1 (ORF1) του γονιδιώματος του ιού και απαρτίζεται από περίπου 160 αμινοξέα. Η αλληλεπίδραση των τομέων με ΑDP-ριβόζη ή παρόμοια μόρια πιθανολογείται πως εμπλέκεται στον αναδιπλασιασμό του ιικού RNA. Σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζεται η έκφραση σε υψηλά ποσοστά της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης του macro τομέα των ιών της Ηπατίτιδας Ε και της Εγκεφαλίτιδας Ιπποειδών της Βενεζουέλας καθώς και η ανάκτηση πληροφοριών για την διαμόρφωση, την δυναμική και την αλληλεπίδραση των πολυπεπτιδίων με την ADP-ριβόζη, σε διάλυμα μέσω της Φασματοσκοπίας NMR. Η έκφραση των πολυπεπτιδίων πραγματοποιήθηκε σε βακτηριακά στελέχη E.coli, σε κατάλληλα επισημασμένο θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων (Μ9) για μελέτη μέσω Φασματοσκοπίας NMR, και απομονώθηκαν μέσω χρωματογραφίας συγγένειας και μοριακού αποκλεισμού. Η εύρεση των κατάλληλων συνθηκών έκφρασης και απομόνωσης των πρωτεϊνών εξασφάλισε δείγματα υψηλής πρωτεϊνικής απόδοσης και καθαρότητας ενώ πραγματοποιήθηκε καταγραφή ομο & ετερο- πυρηνικών φασμάτων NMR 1D & 2D η ανάλυση των οποίων βρίσκεται σε εξέλιξη.