Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας πολυπεπτιδικών τμημάτων της Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης ARKADIA 2

• Κύριος συγγραφέας: Γιάνναρη, Δανάη Δέσποινα
• Άλλοι συγγραφείς: Σπυρούλιας, Γεώργιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2016
• Θέματα: Ε3 Λιγάσες; RING τομέας; Ουβικιτινίωση; Φασματοσκοπία NMR; Arkadia 2; E3 Ligases; RING domain; Ubiquitination; NMR Spectroscopy; 612.398

Η πρωτεϊνική αποικοδόμηση επιτελείται είτε μέσω λυσοσωμικής πρωτεόλυσης είτε μέσω της ουβικιτινο-εξαρτώμενης διαδικασίας στο πρωτεάσωμα. Το μονοπάτι της ουβικιτίνης/πρωτεασώματος στο οποίο καταλήγουν πολλές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες είναι μία ζωτική λειτουργία για την ομοιόσταση του κυττάρου και κατ’ επέκταση του οργανισμού. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση απαιτεί τη συμμετοχή 3 τύπων ενζύμων, του Ε2 ενζύμου-εκκινητή του καταρράκτη αντιδράσεων, του Ε2 ενζύμου μεταφορέα της ουβικιτίνης και της Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης. Ο εξέχων ρόλος των Ε3 ενζύμων διακρίνεται αφενός για το γεγονός ότι γεφυρώνει την απόσταση μεταξύ της πρωτεΐνης-στόχου και της ουβικιτίνης προκαλώντας έμμεσα τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού και αφετέρου για τον υψηλό βαθμό εκλεκτικότητας και εξειδίκευσης των υποστρωμάτων τους (Ε2 ένζυμο, αποικοδομητέα πρωτεΐνη). Η πρωτεΐνη Arkadia2C/RNF165 ανήκει στην κατηγορία των Ε3 λιγασών με το χαρακτηριστικό μοτίβο δέσμευσης ιόντων Zn(II) RING-H2 τύπου cross-brace το οποίο εδράζεται στο C-τελικό της άκρο. Ο καταλυτικός τομέας αποτελείται από 41 αμινοξικά κατάλοιπα με 2 κέντρα δέσμευσης των μεταλλοϊόντων και διάταξη C3H2C3. Η ενζυμική της δράση ασκείται στο βιοχημικό μονοπάτι των Μορφοτικών Πρωτεϊνών των Οστών (ΒΜΡ), ένα συγγενές μονοπάτι του TGF-β. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν 3 πολυπεπτιδικά τμήματα του καρβοξυ-τελικού άκρου της Ark2C, αυξανόμενου μεγέθους, και 2 μεταλλάγματα ενός εξ αυτών. Πιο συγκεκριμένα, αφορούν στο τμήμα αγρίου τύπου Wt του C-τελικού άκρου της RNF165 με 68aa στο οποίο εμπεριέχεται ο RING τομέας, στο C-τελικό τμήμα 110aa το οποίο διαφέρει από το Wt λόγω της επιμήκυνσης του προς το Ν-τελικό άκρο και στο Full length τμήμα μήκους 279 αμινοξέων. Τα 2 μεταλλάγματα αφορούν στην αντικατάσταση της Trp324 του Wt σε Ala (W324A) και Arg (W324R) αντίστοιχα. Όλα τα ανασυνδυασμένα τμήματα κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν με τεχνικές Μοριακής Βιολογίας ενώ για την NMR δομική μελέτη, όσων από αυτά ήταν εφικτό, επισημάνθηκαν με ενεργούς πυρήνες 13C και 15Ν μια συνθήκη αναγκαία για τη φασματοσκοπική αυτή τεχνική. Σύμφωνα με το σύνολο των φασμάτων, τα πρωτεϊνικά μόρια Wt, W324A και W324R Long είναι καλά δομημένα και αναδιπλωμένα. Οι σημειακές μεταλλάξεις δεν επηρέασαν το σχηματισμό της δευτεροταγούς δομής. Οι μετρήσεις Ατομικής Απορρόφησης επαλήθευσαν ότι ο τομέας RING του Wt δεσμεύει 2 ιόντα Zn2+ ενώ παράλληλα τα δεδομένα των τιτλοδοτήσεων με EDTA, μέσω της φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού, απέδειξαν την αναγκαιότητα της συναρμογής του ψευδαργύρου στη σταθερότητα του τομέα. Επίσης, διαφαίνεται από τις NMR μελέτες αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο UbcH5b ότι διαθέτει την ικανότητα πρόσδεσης σε αυτό, όπως συμβαίνει με το ομόλογο τμήμα της Arkadia/RNF111. Η αλληλεπίδραση του τμήματος W324R με το χηλικό παράγοντα EDTA επιβεβαίωσε τη σημασία του Zn(II) στη διαμόρφωση του μοτίβου. Ωστόσο, η παρουσία περίσσειας ZnSO4 δείχνει ότι ενδεχομένως πρόκειται για αντιστρεπτή αντίδραση καθώς το μόριο ανέκτησε την αρχική του αναδίπλωση. Το φαινόμενο αυτό, όμως, δεν επαναλήφθηκε στην περίπτωση της Wt πρωτεΐνης. Τέλος, κατά την NMR πειραματική μελέτη του πολυπεπτιδικού τμήματος 110aa φαίνεται ότι τα επιπλέον κατάλοιπα της αμινοτελικής ουράς παρουσιάζουν μια ιδιάζουσα ευκίνητη συμπεριφορά. Φαίνεται ότι ο πυρήνας του είναι δομημένος αλλά συνολικά η πρωτεΐνη δεν έχει καλή αναδίπλωση. Η μελέτη της Full length πρωτεΐνης κρίθηκε περιορισμένη εξαιτίας του σχηματισμού έγκλειστων σωματίων.