| Περίληψη: | Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η ανάπτυξη των φυσιολογικών κυττάρων καθορίζεται και ελέγχεται αυστηρά από συγκεκριμένους μηχανισμούς. Διατάραξη ή απώλεια των μηχανισμών αυτών οδηγεί στη δημιουργία καρκινικών κυττάρων με κύρια χαρακτηριστικά τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και την ικανότητα εξάπλωσης τους σε άλλους ιστούς. Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο καθώς εμπλέκεται τόσο στη διαδικασία διαφοροποίησης των κυττάρων όσο και στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Συμβάλλει στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας αποτρέποντας την πραγματοποίηση του διπλασιασμού του DNA περισσότερες από μία φορές σε κάθε κύκλο, μέσω της αλληλεπίδρασής της με τον παράγοντα Cdt1. Ταυτόχρονα, η Geminin ρυθμίζει την κυτταρική διαφοροποίηση καθώς αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες και σύμπλοκα αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Ένα τέτοιο σύμπλοκο είναι και το Polycomb 2 (PRC2), με το οποίο φαίνεται να δρα συνεργατικά, συμβάλλοντας στη ρύθμιση της κατασταλτικής του δράσης. Η χημική ένωση 3-deazaneplanοcin A (3-από(δε)αζανεπλανοσινη Α) (DZNep) είναι αναστολέας της Ν-μεθυλτρανφεράσης (ΕΖΗ2), η οποία είναι κατεξοχήν καταλυτική υπομονάδα του PRC2. Είναι υπεύθυνη για την τριμεθυλίωση της λυσίνης 27 στην ιστόνη Η3, που διατηρεί τα γονίδια στόχους σε μια ανενεργό κατάσταση. Χορήγησή του αναστολέα σε λευχαιμικά κύτταρα οδηγεί στην μείωση της έκφρασης της ΕΖΗ2 και στην αύξηση της έκφρασης του λευχαιμιογόνου γονιδίου HOXA9 που ρυθμίζεται από το σύμπλοκο. Επιπλέον επάγει την απόπτωση καρκινικών κυττάρων και αναστέλλει την ανάπτυξη της καλλιέργειάς τους in vitro.
Στη παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η επίδραση του χημικού αναστολέα DZNep στην ανάπτυξη λευχαιμικών κυττάρων. Επιπλέον εξετάσθηκε η ανάπτυξη των διαμολυσμένων με shRNA κυττάρων, για την σίγαση της Geminin. Τέλος ερευνήθηκε το αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης του χημικού αναστολέα και της αποσιώπησης της Geminin στην ανάπτυξη της καλλιέργειας καρκινικών κυττάρων καθώς και στην έκφραση του γονιδίου HOXA9.
Συγκεκριμένα για τη διερεύνηση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα της σειράς Κ562. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο στο οποίο είχε προστεθεί o αναστολέας DZNep σε διάφορες συγκεντρώσεις και ακολούθησε καταμέτρησή τους σε διαφορετικά χρονικα διαστήματα. Επιπλέον, μελετήθηκε η ανάπτυξη κυττάρων Κ562 διαμολυσμένων με shRNA για τη σίγαση του γονιδίου της Geminin, σε σύγκριση με αυτή των κυττάρων που εκφράζουν το γονιδιο. Τέλος, έγινε συνδυασμός των δύο παραπάνω για να μελετηθεί η δράση της σίγασης της Geminin ταυτόχρονα με χορήγηση του DZNep σε Κ562. Λήφθηκαν δείγματα κυττάρων από κάθε συνθήκη και ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση του γονιδίου της Geminin αλλά και του HOXA9 με Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Πραγματικού Χρόνου (Real Time PCR). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων στα οποία είχε χορηγηθεί ο DZNep, ανάλογη με την συγκέντρωση του αναστολέα στην καλλιέργεια. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξηση της ανάπτυξης των κυττάρων με την αποσιώπηση της Geminin. Τέλος, παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των διαμολυσμένων με shRNA κυττάρων με την προσθήκη του DZNep, αντίστοιχη με αυτή που παρουσιάστηκε στα κύτταρα που εκφράζουν τη Geminin.
Συμπερασματικά, η παρουσία ή απουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δράση του αναστολέα ο οποίος επιβραδύνει την ανάπτυξη των λευχαιμικών κυττάρων in vitro. Από την αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου προέκυψε ότι: 1) η έκφραση του HOXA9 είναι αμελητέα στα Κ562 κύτταρα, υπο φυσιολογικές συνθήκες, ενώ αυξάνεται σημαντικά με την in vitro απαλοιφή της Geminin, 2) η έκφραση του γονιδίου αυξάνεται ακόμα περισσότερο μετά τη χορήγηση του αναστολέα DZNep. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν από τη μία την αντιλευχαιμική δράση του αναστολέα και από την άλλη την πιθανή συνεργατική δράση της σίγασης της Geminin και του DZNep στην ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων.
|
|---|
