| Περίληψη: | Η νόσος του Άνθρακα είναι μια οξεία μολυσματική ασθένεια που έγινε ιδιαιτέρως γνωστή από τη χρήση της ως βιολογικό όπλο σε τρομοκρατικές επιθέσεις μετά τα γεγονότα της 11ης Σεπτεμβρίου 2001. Η νόσος οφείλεται στην παθογόνο δράση του βάκιλλου Bacillus anthracis, ενός (+)-Gram βακτηρίου. Η δυσκολία στην αντιμετώπιση της νόσου και η συνεπαγόμενη αυξημένη νοσηρότητα οφείλονται συχνά στην καθυστερημένη διάγνωση και θεραπεία, καθώς τα αρχικά συμπτώματα είναι μη ειδικά. Η τοξική δράση του βάκιλλου οφείλεται στη συνεργιστική δράση 3 πρωτεΐνων που εκφράζει, το Προστατευτικό Αντιγόνο, το Παράγοντα Οιδήματος και τον Θανατηφόρο Παράγοντα. Ο Θανατηφόρος Παράγοντας αποτελεί μια μεταλλοπρωτεάση που πρωτεολύει μέλη της οικογένειας των MAPKKs, δημιουργώντας διαταραχή της κυτταρικής ομοιόστασης που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Ο Θανατηφόρος Παράγοντας, που αποτελεί και το αντικείμενο μελέτης της παρούσας ερευνητικής εργασίας, αποτελείται από 4 τομείς, από τους οποίους ο τομέας Ι και ο τομέας IV παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω του ρόλου του στην παθογένεια της νόσου. Πιο συγκεκριμένα, ο τομέας Ι επιτρέπει την είσοδο της πρωτεΐνης στο εσωτερικό του κυττάρου η οποία είναι απαραίτητη για την άσκηση της τοξικής δράσης, ενώ ο τομέας IV περιέχει το καταλυτικό κέντρο μεταλλοπρωτεάσης. στην παρούσα εργασία, έγινε προσπάθεια έκφρασης πολυπεπτιδικών τμημάτων των δύο αυτών τομέων και ακόλουθη εφαρμογή NMR φασματοσκοπίας για το δομικό χαρακτηρισμό τους. Λόγω του εξαιρετικά μεγάλου μήκους των πολυπεπτιδίων, εφαρμόσθηκαν καινοτόμα πρωτόκολλα που αφορούν τόσο στη διαδικασία παρασκευής των πρωτεΐνικών δειγμάτων ώστε να πληρούν τα κριτήρια για τη διενέργεια NMR πειραμάτων, όσο και στην καθεαυτή εφαρμογή της NMR φασματοσκοπίας και ανάλυσης των φασμάτων. Με τη χρήση των τεχνικών αυτών, ολοκληρώθηκε με επιτυχία η έκφραση, απομόνωση και λήψη όμο- και έτερο-, 1D, 2D και 3D NMR φασμάτων για το δομικό χαρακτηρισμό του πολυπεπτιδίου με MB > 27KDa, που αντιστοιχεί σε ολόκληρο το δομημένο τμήμα του Τομέα Ι. Μετά από ανάλυση των φασμάτων, ολοκληρώθηκε η αποτίμηση των χημικών μετατοπίσεων των πυρήνων του πολυπεπτιδικού σκελετού , καθώς και η πρόβλεψη της δευτεροταγούς του δομής, η οποία έδειξε καταφανείς ομοιότητες με τα μέχρι τώρα γνωστά κρυσταλλογραφικά δεδομένα. Τα πολυπεπτίδια που αντιστοιχούν στον Τομέα ΙV έδειξαν φτωχή διαλυτότητα και αναδίπλωση, παρά τη χρήση καινοτόμων μεθόδων έκφρασης και χρήση αποδιατακτικών μέσων. Το μόνο πολυπεπτίδιο που είχε ήδη δείξει στο παρελθόν σχετικά καλή αναδίπλωση, αν και μήκους μόνο 106 καταλοίπων, χρησιμοποιήθηκε σε μελέτη αλληλεπίδρασης με πεπτιδικό ανάλογο του φυσικού υποστρώματος της καταλυτικής κοιλότητας και η αλληλεπίδραση τους παρατηρήθηκε μέσω καταγραφής της διαφοροποίησης των χημικών μετατοπίσεων.
|
|---|
