Ανάπτυξη μεθοδολογίας προσδιορισμού πεπτιδικού αναλόγου της μυελινικής γλυκοπρωτεΐνης των ολιγοδενδριτών σε διάλυμα με SDS-PAGE

• Κύριος συγγραφέας: Κοντός, Χρήστος
• Άλλοι συγγραφείς: Τσέλιος, Θεόδωρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2016
• Θέματα: Όριο ανίχνευσης; Κατακρήμνιση πρωτεϊνών; Ανάκτηση πεπτιδίου; SDS-PAGE; Limit of detection; Polypeptides; Coomassie brilliant blue; Protein precipitation; Peptide recovery; 665.38

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη κατάλληλης μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης πεπτιδικού αναλόγου σε πλάσμα και σε υδατικό διάλυμα. Το πεπτιδικό ανάλογο που χρησιμοποιήθηκε ήταν τροποποιημένος επίτοπος της Μυελινικής Γλυκοπρωτεΐνης των Ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG) και πιο συγκεκριμένα το πεπτίδιο (Lys-Gly)5MOG35-55(Pro42). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE), ενώ έγιναν δοκιμές σε πηκτές διαχωρισμού διαφόρων συγκεντρώσεων (10%, 12%, 16,5%, 18%, 20%) και σε διαφορετικές θερμοκρασίες (4oC, 25oC). Ο έλεγχος ανίχνευσης έγινε σε μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων του πεπτιδίου, από 0,25 mg/ml έως 0,00125 mg/ml. Δείκτης μοριακών βαρών ήταν ο Polypeptide με εύρος μοριακών βαρών 1,4-26,6 kDa ενώ η χρώση της πηκτής έγινε με χρώση κυανού της Coomassie (Coomassie Brilliant Blue). Επίσης έγινε μελέτη εύρεσης κατάλληλης μεθοδολογίας για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών του πλάσματος, διατηρώντας παράλληλα το πεπτίδιο στο διάλυμα ανέπαφο. Η μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν η κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με την προσθήκη διαφόρων αντιδραστηρίων. Ειδικότερα δοκιμάστηκαν οργανικοί διαλύτες, οξέα, βάσεις, άλατα, πολυμερή ενώ έγινε και δοκιμή με οργανικό διάλυμα οξέων, βάσεων, αλάτων και πολυμερών. Η δυσκολία έγκειται στην επιτυχή ανάκτηση του πεπτιδίου, καθώς στα πεπτίδια μέσου μοριακού βάρους, από 1,5 έως 4 kDa, έχει παρατηρηθεί συγκατακρήμνισή τους μαζί με τις πρωτεΐνες του πλάσματος και μικρή ανάκτηση. Η ανάλυση των δειγμάτων έγινε με SDS-PAGE με πρότυπο διάλυμα δεικτών μοριακού βάρους τον Polypeptide (1,4-26,6 kDa), ενώ η χρώση της πηκτής έγινε με χρώση κυανού της Coomassie (Coomassie Brilliant Blue).