| Περίληψη: | Οι τροφικές αλλεργίες ορίζονται σαν μια απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος στις πρωτεΐνες των τροφίμων. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Ένωση, η ύπαρξη αλλεργιογόνων στα τρόφιμα πρέπει να αναγράφεται στη συσκευασία. Η βιομηχανία τροφίμων έχει ορίσει ανώτερα όρια της ποσότητας των αλλεργιογόνων που επιτρέπεται να υπάρχει στα τρόφιμα, είτε αυτά έχουν προστεθεί κατά την παραγωγή, είτε λόγω διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Για το λόγο αυτό υπάρχει ανάγκη για την ανάπτυξη αναλυτικών τεχνικών για την ανίχνευση αλλεργιογόνων ουσιών στα επεξεργασμένα τρόφιμα. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στις πρωτεΐνες των τροφίμων είτε στο γονιδιακό τους υλικό. Το DNA είναι προτιμότερος αναλύτης, επειδή παρουσιάζει μεγαλύτερη ανθεκτικότητα ιδιαίτερα κατά την επεξεργασία των τροφίμων.
Στην εργασία αυτή θα παρουσιαστεί η ανάπτυξη δύο μεθόδων, που βασίζονται στο DNA, για την ανίχνευση διαφόρων ξηρών καρπών. Πιο συγκεριμένα, παρουσιάζεται η ανάπτυξη μιας χημειοφωταυγειομετρικής και μιας φθορισμομετρικής μεθόδου για την ανίχνευση διαφόρων ξηρών καρπών. Οι μέθοδοι εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των ξηρών καρπών φιστικιού, φουντουκιού και καρυδιού, τόσο σε ωμούς ξηρούς καρπούς, όσο και σε επεξεργασμένα τρόφιμα.
Στο κεφάλαιο 1, παρουσιάζονται τα διάφορα αλλεργιογόνα και ειδικότερα των τροφίμων, καθώς και οι μέθοδοι ανίχνευσής τους. Παρουσιάζονται οι γενικές αρχές των μεθόδων αυτών οι οποίες μπορεί να βασίζονται είτε σε πρωτεΐνες είτε στο DNA, καθώς και οι βασικές αρχές μιας άλλης μεθόδου ανίχνευσης, της κυτταρομετρίας ροής. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), ως η πιο σημαντική τεχνική εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA, η οποία αποτελεί αναπόσπαστο μέρος κάθε σύγχρονης μεθόδου ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Τέλος, επισημαίνεται και η μέθοδος προσδιορισμού των προϊόντων της PCR.
Το 2ο κεφάλαιο, περιλαμβάνει την έννοια της χημειοφωταύγειας. Αναφέρονται επίσης, οι βασικότερες χημειοφωταυγειομετρικές και βιοφωταυγείς αντιδράσεις που πραγματοποιούνται με τη χρήση κατάλληλων υποστρωμάτων.
Αντικείμενο του κεφαλαίου 3, είναι η ανίχνευση των νουκλεϊκών οξέων μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης, σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Παρουσιάζονται τα διάφορα στερεά υποστρώματα με τα οποία μπορεί να είναι κατασκευασμένα τα φρεάτια αυτά. Γίνεται αναφορά επίσης στα διάφορα συστήματα τα οποία χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση.
Στο κεφάλαιο 4 παρέχεται σύντομη περιγραφή της αρχής λειτουργίας και της οργανολογίας της κυτταρομετρίας ροής, η οποία αποτελεί ένα ισχυρό αναλυτικό εργαλείο για τη διερεύνηση ιδιοτήτων μικροσωματιδίων (π.χ. κυττάρων αλλά και συνθετικών μικροσφαιριδίων).
Στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται η διαδικασία απομόνωσης γενωμικού υλικού από τους ξηρούς καρπούς, καθώς και από επεξεργασμένα τρόφιμα, όπως μπισκότα, τα οποία παρασκευάστηκαν και περιείχαν και τους τρείς ξηρούς καρπούς σε ποσοστά από 0,01-5%. Στη συνέχεια, ειδικές αλληλουχίες του DNA των ξηρών καρπών ενισχύονται μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Τέλος, παρέχονται τα αποτελέσματα από τις παραπάνω διαδικασίες.
Αντικείμενο του κεφαλαίου 6 της παρούσας εργασίας είναι μια δοκιμασία υβριδοποίησης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Η ανίχνευση και η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA βασίζεται σε επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο- ανιχνευτή, ειδικό για κάθε ξηρό καρπό. Πιο αναλυτικά, κάθε ενισχυμένο προϊόν PCR είναι βιοτινυλιωμένο και υβριδοποιείται με το ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή, ο οποίος φέρει μια πολυ-(dΑ) ουρά στο ένα άκρο του. Στη συνέχεια τα υβρίδια δεσμεύονται από πολύ-(dT) αλληλουχίες που είναι ακινητοποιημένες σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης λόγω (dA)/(dT) υβριδοποίησης. Η ανίχνευση των υβριδίων γίνεται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης (SA-ALP) μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Η προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος του ενζύμου οδηγεί στην παραγωγή χημειοφωταύγειας, η ένταση της οποίας είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της αλληλουχίας στο δείγμα. Η μέθοδος εφαρμόστηκε για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των ξηρών καρπών αραχίδων, φουντουκιού και καρυδιού, τόσο σε ωμούς και ψημένους ξηρούς καρπούς, όσο και σε επεξεργασμένα τρόφιμα. Πρότυπες καμπύλες αναφοράς κατασκευάστηκαν και για τους τρείς ξηρούς καρπούς, ενώ το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν 1,4 ρΜ και για τις τρεις αλληλουχίες DNA, ενώ κατέστη δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση και των τριών ειδών σε ποσοστό 0,01%.
Τέλος, στο κεφάλαιο 7 παρουσιάζονται πολλαπλές φθορισμομετρικές δοκιμασίες υβριδοποίησης DNA σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Κάθε μικροσφαιρίδιο περιέχει δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία και με αυτόν τον τρόπο έχει καταστεί ένα φασματικά κωδικοποιημένο στερεό υπόστρωμα για την εκτέλεση δοκιμασιών υβριδιποίησης. Ειδικά ολιγονουκλεοτίδια – ανιχνευτές προσδένονται ομοιοπολικά στην επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου. Η αλληλουχία του DNA υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια. Τα υβρίδια ανιχνεύονται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης- φυκοερυθρίνης. Τα μικροσφαιρίδια αναλύονται τέλος μέσω ενός κυτταρομετρητή ροής ο οποίος περιλαμβάνει δύο δέσμες λέιζερ. Η μία δέσμη λέιζερ είναι υπεύθυνη για την ταξινόμηση των μικροσφαιριδίων, ενώ η δεύτερη δέσμη διεγείρει τη φυκοερυθρίνη. Η
ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του προϊόντος PCR. Πρότυπες καμπύλες αναφοράς κατασκευάστηκαν και για τους τρείς ξηρούς καρπούς, ενώ το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν 1,4 ρΜ και για τις τρεις αλληλουχίες DNA, ενώ κατέστη δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση και των τριών ειδών σε ποσοστό 0,02%.
|
|---|
