| Περίληψη: | Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε η ικανότητα του μύκητα Mortierella isabellina να συσσωρεύει αποθεματικά υλικά (λιπίδια, πολυσακχαρίτες) σε διάφορες συνθήκες καλλιέργειας, η ροή του άνθρακα κατά τις διεργασίες βιοσύνθεσης και αποδόμησης των πλούσιων σε ενέργεια αποθεματικών υλικών και τέλος, το φαινόμενο παρεμπόδισης από τη γλυκερόλη στον καταβολισμό της γλυκόζης και vice versa. Ο μύκητας καλλιεργούμενος σε θρεπτικό υλικό περιοριστικό ως προς άζωτο, με πηγή άνθρακα γλυκόζη 40 g/l, συσσώρευσε αποθεματικά λιπίδια σε ποσοστό 68,7% επί της ξηρής βιομάζας, τα οποία αποδομήθηκαν σε συνθήκες πενίας άνθρακα (L/x% = 50%). Η ενέργεια από την αποδόμησή τους διοχετεύθηκε προς κάλυψη των ενεργειακών αναγκών του μύκητα και η συγκέντρωση των πολυσακχαριτών ήταν 2,4 g/l. Όταν ο μύκητας καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υλικό διπλά περιοριστικό (ως προς άζωτο και μαγνήσιο), συσσώρευσε 72,6% αποθεματικά λιπίδια, ενώ η αποδόμησή τους ήταν περιορισμένη. Η συγκέντρωση των πολυσακχαριτών έφτασε τα 1,4 g/l. Στην πρώτη περίπτωση, όταν σε συνθήκες πενίας άνθρακα πραγματοποιήθηκε εμπλουτισμός του θρεπτικού υλικού με θειικό αμμώνιο, η αποδόμηση των λιπιδίων ήταν ραγδαία και η ενέργεια διοχετεύθηκε προς την παραγωγή νέας ελεύθερης λιπιδίων κυτταρικής μάζας, πλούσια σε πολυσακχαρίτες (3,3 g/l) και πρωτεΐνες. Καλλιέργεια του μύκητα σε θρεπτικό υλικό διπλά περιοριστικό, με πηγή άνθρακα και ενέργειας γλυκόζη 100 g/l σε φιάλες πραγματοποιήθηκε και η συσσώρευση των αποθεματικών λιπιδίων ήταν 71,1%, ενώ η συγκέντρωση των πολυσακχαριτών ήταν 2,9 g/l. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια σε κλειστό σύστημα σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας και ο μύκητας συσσώρευσε λιπίδια σε ικανοποιητικό ποσοστό επί της ξηρής βιομάζας (64,1%), ωστόσο η παραγωγή βιομάζας ήταν περιορισμένη. Έτσι, η καλλιέργεια επαναλήφθηκε και στις 144 h το σύστημα άλλαξε σε καλλιέργεια ημι-συνεχούς λειτουργείας με ρυθμό αραίωσης D = 0,028 l/h. Σε αυτές τις συνθήκες ο μύκητας δε μπόρεσε να ανταπεξέλθει. Επιπλέον, λόγω της ανάδευσης, παρατηρήθηκε και σπάσιμο του μικκυλίου. Στη συνέχεια, ο M. isabellina καλλιεργήθηκε σε γλυκερόλη 50 g/l. Η βιομάζα έφτασε τα 5,5 g/l και η συσσώρευση των ενδοκυτταρικών λιπιδίων ήταν 39,5%. Έτσι πραγματοποιήθηκε συν-καλλιέργεια σε γλυκερόλη 50 g/l και γλυκόζη 30 g/l. Σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε μια χρονική καθυστέρηση στον καταβολισμό της γλυκόζης, ενώ αφομοίωση της γλυκερόλη δεν παρατηρήθηκε. Στη συνέχεια, ο μύκητας καλλιεργήθηκε σε τέσσερις συνδυασμούς γλυκερόλης/γλυκόζης, τέτοιοι ώστε συνολικά η αρχική συγκέντρωση στο μέσο καλλιέργειας να είναι 100 g/l πηγή άνθρακα. Σε όλες τις περιπτώσεις, παρουσία γλυκόζης δεν παρατηρήθηκε αφομοίωση της γλυκερόλης, ενώ επηρεάστηκε και ο καταβολισμός της γλυκόζης. Σε ορισμένες περιπτώσεις αυτή δεν αφομοιώθηκε πλήρως. Προκειμένου να εξεταστεί εάν υπάρχει κάποια τιμή γλυκερόλης που προκαλεί παρεμπόδιση στον καταβολισμό της γλυκόζης, πραγματοποιήθηκε νέο σετ συν-καλλιεργειών σε γλυκόζη 40 g/l και γλυκερόλη 20, 40, 60 και 80 g/l. Σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε φαινόμενο διαύξησης του μύκητα, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις η γλυκόζη καταναλώθηκε πλήρως, ωστόσο χρονικά καθυστερημένα συγκριτικά με μονο-καλλιέργεια σε γλυκόζη 40 g/l. Τέλος, μελετήθηκαν τα βιοχημικά γεγονότα της ροής του άνθρακα από το υπόστρωμα (γλυκόζη) προς βιοσύνθεση και αποδόμηση αποθεματικών υλικών. Σε συνθήκες ισόρροπης αύξησης, παρά την παρουσία αζώτου στο μέσο καλλιέργειας, πραγματοποιήθηκε διοχέτευση του άνθρακα προς βιοσύνθεση λιπιδίων και πολυσακχαριτών. Μεταβαίνοντας στην πρώιμη ελαιογόνο φάση αύξησης πραγματοποιήθηκε κυρίως βιοσύνθεση λιπιδίων, το ποσοστό των οποίων αυξήθηκε από 9,6 σε 32,7% επί της ξηρής βιομάζας. Η δραστικότητα της ATP:CL, ένζυμο που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση λιπιδίων, ήταν υψηλή και της ICDH χαμηλή. Επιπλέον, η δραστικότητα της PFK, η οποία καταλύει τον καταβολισμό της γλυκόζης μέσω της γλυκολυτικής οδού ήταν υψηλή. Στην όψιμη ελαιογόνο φάση αύξησης, παρατηρήθηκε αλληλομετατροπή των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών σε λιπίδια και σε συνδυασμό με τον καταβολισμό του υποστρώματος οδήγησαν σε μέγιστη συσσώρευση ενδοκυτταρικών λιπιδίων (L/x% = 68,7%). Η ICDH παρεμποδίστηκε, ως αποτέλεσμα της μειωμένης ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης του AMP και η δραστικότητα της ATP:CL ήταν ψηλή, με αποτέλεσμα το κιτρικό που εκκρίνεται στο κυτταρόπλασμα να διασπαστεί προς ακετυλο-CoA και οξαλοξικό. Επιπλέον, οι δραστικότητες των PGM και FBP ήταν υψηλές, υποδεικνύοντας αποδόμηση και αναδιοργάνωση των πολυσακχαριτών. Κατά τη φάση αποδόμησης των λιπιδιακών αποθεμάτων, όταν αυτή σχετίζεται με ενεργειακή συντήρηση των κυττάρων, η δραστικότητα της FBP είναι αυξημένη, ενώ της UDPG χαμηλότερη, υποδεικνύοντας αναδιοργάνωση των συσσωρευμένων πολυσακχαριτών. Αντίθετα, στην περίπτωση που η αποδόμηση σχετίζεται με την παραγωγή νέας βιομάζας, παρατηρείται υψηλότερη συσσώρευση πολυσακχαριτών και πρωτεϊνών. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός πως σε όλες τις φάσεις ανιχνεύεται δραστικότητα της ACOX, υποδεικνύοντας συνεχή αναδιάταξη των λιπιδίων. Επίσης, οι υψηλές δραστικότητες των UDPG, PGM, TALDO, FBP, ένζυμα-κλειδιά στο μεταβολισμό των πολυσακχαριτών, δείχνουν συνεχή βιοσύνθεση, αποδόμηση και αναδιοργάνωση αυτών μέσου του κύκλου των φωσφοροπεντοζών και της γλυκονεογένεης.
|
|---|
