| Περίληψη: | Ο έλεγχος της αυθεντικότητας των τροφίμων είναι ένα ζήτημα που απασχολεί τους διεθνής και κρατικούς μηχανισμούς με σκοπό την προστασία των καταναλωτών. Κατά συνέπεια, υπάρχει αυξανόμενη ζήτηση για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων αναλυτικών μεθόδων για την μελέτη της αυθεντικότητας των προϊόντων διατροφής, καθώς και της ανίχνευσης νοθείας. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μια νέα πολυαναλυτική μέθοδος για την ταυτοποίηση προϊόντων διαφόρων ειδών κρέατος, βασιζόμενη στο γενωμικό τους υλικό και στη χρήση φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση κρέατος βοδινού, χοιρινού, αμνού, αλόγου, κοτόπουλου και γαλοπούλας.
Στο πρώτο κεφάλαιο της παρούσας εργασίας γίνεται αναφορά στην Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR), στα στάδια της μεθόδου καθώς και στην βελτιστοποίησή της, καθώς αποτελεί την πιο σημαντική μέθοδο εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA. Ακόμα παρουσιάζεται η μέθοδος της ποσοτικής PCR.
Στο δεύτερο κεφάλαιο αναφέρονται διάφοροι μέθοδοι ανίχνευσης των νουκλεϊκών οξέων που αποτελούν ένα πολύ σημαντικό εργαλείο για την Αναλυτική Χημεία στην ανίχνευση DNA καθώς και RNA. Περιγράφονται ακόμα ετερογενείς και ομογενείς δοκιμασίες υβριδοποίησης και διάφορες παραλλαγές που διευκολύνουν την εκτέλεσή τους.
Στο τρίτο κεφάλαιο παρουσιάζονται διάφορες μοριακές μέθοδοι ανάλυσης τροφίμων, εκτός από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Η επιστημονική βιβλιογραφία έχει να επιδείξει έναν μεγάλο αριθμό πρωτοκόλλων ανάλυσης για μια πληθώρα νοθειών διαφόρων κατηγοριών σε πολλά είδη τροφίμων, επεξεργασμένα και μη. Κατά συνέπεια, τα αναλυτικά «εργαλεία» που είναι διαθέσιμα για την ανίχνευση της νοθείας είναι αρκετά και σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μόρια ή ομάδα μορίων – στόχων συνήθως καλύπτουν όλες τις περιπτώσεις.
Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζεται το πρώτο μέρος της πειραματικής πορείας. Αρχικά, DNA που απομονώθηκε από δείγμα κρέατος υποβλήθηκε σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), στην οποία ειδικές αλληλουχίες DNA για τα δείγματα βοδινού, χοιρινού, αμνού, αλόγου, κοτόπουλου και γαλοπούλας ενισχύθηκαν εκθετικά. Τα μεγέθη των ενισχυμένων θραυσμάτων ήταν 83 bp, 154 bp, 88 bp, 107 bp, 72 bp και 223 bp, αντίστοιχα. Τα προϊόντα της PCR είναι βιοτινυλιωμένα προκειμένου να επιτευχθεί η περαιτέρω ανίχνευσή τους, ταυτόχρονα, μέσω μιας πολυαναλυτικής δοκιμασίας υβριδοποίησης στην επιφάνεια φασματικά κωδικοποιημένων φθορίζοντων μικροσφαιριδίων.
Τέλος, αντικείμενο του πέμπτου και τελευταίου κεφαλαίου της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη πολλαπλών φθορισμομετρικών δοκιμασιών DNA σε εναιώρημα φασματικών διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Τα μικροσφαιρίδια αυτά περιέχουν στο εσωτερικό τους δύο φθορίζουσες χρωστικές σε διάφορες αναλογίες, δημιουργώντας έως 100 διαφορετικούς πληθυσμούς. Ο κάθε πληθυσμός συζευγνύεται ομοιοπολικά με κατάλληλα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές ειδικά για κάθε είδος κρέατος. Μίγμα των προϊόντων PCR, έπειτα από θερμική αποδιάταξη, αφήνεται να υβριδοποιηθεί με μίγμα που περιέχει 6 πληθυσμούς μικροσφαιριδίων ειδικούς για τις 6 υπό εξέταση αλληλουχίες DNA. Τα υβρίδια ανιχνεύονται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης. Τα μικροσφαιρίδια αναλύονται τέλος με κυτταρομετρία ροής. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, κάθε μικροσφαιρίδιο ακτινοβολείται με 2 λέιζερ ταυτόχρονα (635nm και 532nm). Η ακτίνα στα 635nm κατηγοριοποιεί τα μικροσφαιρίδια, ενώ η ακτίνα 532nm διεγείρει την φυκοερυθρίνη, η ένταση φθορισμού της οποίας είναι ανάλογη με την ποσότητα της συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. Η ύπαρξη 100 διαφορετικών πληθυσμών μικροσφαιριδίων επιτρέπει την επέκταση της προτεινόμενης μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό περισσότερων ειδών κρέατος.
|
|---|
