| Περίληψη: | Η αδειοδότηση εξασφαλίζει τη χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού.
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η
έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη, διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη της
ισορροπίας της ρύθμισης της αντιγραφής οδηγεί σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο
πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο.
Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό επίσης προκαλείται από βλάβες στο γενετικό
υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν
κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των βλαβών έχουν εξελικτικά
προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Ο
παράγοντας Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά
της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη.
Στο πρώτο μέρος της μελέτης θα γίνει χαρακτηρισμός μια μεθόδου που προκαλεί ολική ή
εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό κυττάρων με χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη
τεχνική αυτή θα μελετηθεί σε καρκινικές σειρές η πρωτεΐνη Cdt1 και η ταχύτητα πρωτεόλυσής της.Σε μικροσκόπιο φθορισμού θα μελετηθεί ο εντοπισμός και σε συνεστιακό μικροσκόπιο η κινητική
της πρωτεΐνης αυτής, καθώς και η μεταλλαγμένη μορφή Cdt1 (Cdt1+4A), η οποία δεν αλληλεπιδρά
με το πρωτεολυτικό μηχανισμό Cul4-DDB1Cdt2,. Η μελέτη της κινητικής γίνεται σε ζωντανά
κύτταρα καρκινικών σειρών με σκοπό την κατανόηση της ιεράρχησης των γεγονότων που
συμβαίνουν σε περιοχές στοχευμένης βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία στο γενετικό υλικό. Με
την τεχνική επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (Fluoresent Recovery After
Photobleaching) θα παρακολουθηθεί η επαναφορά του σήματος με σκοπό την ποσοτικοποίηση της
δεσμευμένης πρωτεΐνης.
Στο δεύτερο μέρος της μελέτης θα αναπτυχθούν μέθοδοι κανονικοποίησης και ανάλυσης
6
πειραματικών δεδομένων λειτουργικής μικροσκοπίας με εργαλεία το οποία αναπτύχθηκαν ειδικά
για την ανάλυση πειραμάτων FRAP (easyFRAP). Επίσης αναλύεται η δημιουργία κατάλληλου
λογισμικού και η βελτιστοποίηση τεχνικών παρατήρησης της επαναφοράς του φθορισμού μετά από
μεγάλα χρονικά διαστήματα, της τάξεως των ωρών έναντι της κλασικής μεθόδου όπου η
παρατήρηση διαρκεί κάποια δευτερόλεπτα. Τέλος ακολουθεί σύγκριση της εφαρμογής easyFRAP
με την εφαρμογή FRAPcalc, η οποία χρησιμοποιείται επίσης για την κανονικοποίηση και οπτικοποίηση δεδομένων FRAP.
|
|---|
