Ανάπτυξη εναλλακτικής μεθοδολογίας κλωνοποίησης γονιδίων σε πλασμίδια

• Κύριος συγγραφέας: Κωνσταντίνου, Ευαγγελία
• Άλλοι συγγραφείς: Πουλάς, Κωνσταντίνος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2016
• Θέματα: Κλωνοποίηση; Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες; Cloning; pET-BccI; TA-GC; Recombinant proteins; 572.877

Τα τελευταία χρόνια η έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών έχει γίνει η πιο κοινή μέθοδος παραγωγής πρωτεϊνών οι οποίες στη συνέχεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διάφορους ερευνητικούς, και όχι μόνο, σκοπούς. Για την έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται διάφοροι ξενιστές όπως κύτταρα θηλαστικών, μύκητες, βάκιλλοι, βακτήρια και άλλοι. Η επιλογή του κατάλληλου ξενιστή βασίζεται στα πλεονεκτήματα που προσφέρει καθώς και στο σκοπό για τον οποίο παράγεται η συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Επίσης ποικίλλουν και οι φορείς στους οποίους γίνεται η κλωνοποίηση του επιθυμητού γονιδίου. Συγκεκριμένα ως φορείς έκφρασης μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι βακυλοϊοί, ο φάγος λ, ο φάγος Μ13, τα κοσμίδια ή τα πλασμίδια. Επειδή όμως η έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, τις περισσότερες φορές, γίνεται στο E. coli ως φορείς συχνότερα χρησιμοποιούνται τα πλασμίδια. Η κλωνοποίηση των γονιδίων στα πλασμίδια πρέπει να είναι κατευθυνόμενη, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η έκφραση και επίσης πρέπει να αποφεύγεται η προσθήκη περιττών αλληλουχιών στα 5’ και 3’ άκρα των προς έκφραση γονιδίων προκειμένου να μην εκφράζονται πρωτεΐνες με περιττά αμινοξέα στα NH2- και –COOH άκρα τους. Οι μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί έως τώρα χωρίζονται σε 2 κατηγορίες: τις εξαρτώμενες και τις ανεξάρτητες από τη λιγάση. Και οι δύο κατηγορίες έχουν αρκετά μειονεκτήματα. Στην παρούσα εργασία παρουσιάστηκε η TA-GC μέθοδος κλωνοποίησης ως μία νέα, απλή και αποδοτική μέθοδος για την κατευθυνόμενη κλωνοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σε φορείς έκφρασης. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα έναντι των άλλων μεθόδων που προαναφέρθηκαν. Βασίζεται στη συμπληρωματικότητα μεταξύ μονόκλωνων 5’-A, 5’-G άκρων του γονιδίου, που προήλθαν ύστερα από σύντομη επώαση με την T4 DNA πολυμεράση και των 5’-Τ, 5’-C άκρων του φορέα pET-BccI, που δημιουργήθηκε στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, ύστερα από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BccI. Ο φορέας αυτός δίνει επίσης τη δυνατότητα για έλεγχο των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στις αποικίες χάρη στην ύπαρξη θέσεων αναγνώρισης για τα ένζυμα BamHI, EcoRI, HindIII. Για να ελεγχθεί η αξιοπιστία της μεθόδου έγινε κλωνοποίηση στο φορέα με 2 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι το 61,7% των αποικιών είχε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και το 94,6% εξ’ αυτών κωδικοποιούσε την επιθυμητή πρωτεΐνη, κάνοντας την TA-GC μέθοδο κλωνοποίησης μία αρκετά σημαντική τεχνική για κλωνοποίηση γονιδίων σε φορείς έκφρασης.